Emlős sejtes in cell NMR módszer fejlesztése sejtbejutó hatású víruseredetű peptidekkel konjugált izotópjelölt K-Ras fehérjével
Emlős sejtes in cell NMR módszer fejlesztése céljából izotópjelölt K-Ras fehérjét konjugálunk sejtbejutó hatású víruseredetű peptidekkel. A fehérjét bakteriális expressziós rendszerben állítjuk elő izotópjelölt formában, mind a peptidekkel C-terminális fúziós formában, mind önmagában, alkalmassá téve az előállítást követő natív kémiai ligációra vagy egyéb konjugációs módszerre szintetikus hordozó oligopeptiddel.
A sejtbejutásról először áramlási citometriás vizsgálattal győződünk meg (ebben együttműködő: Bősze Szilvia), ehhez szintetikus úton, fluoreszcens jelzőmolekulával ellátott konstrukció(ka)t állítunk elő. Szükséges lehet távtartó egységet alkalmazni a hordozópeptid és a fehérje között, ez ligáció esetén oligoetilénglikol származék lehet, míg fúziós fehérje esetén pl. oligoglicin szakasz. Az in vitro sejtbejutási vizsgálatok során a fluoreszcensen jelzett konstrukció sejten belüli lokalizációját is vizsgáljuk konfokális mikroszkóppal.
A konstrukciók előállítását követően először a 15N-jelölt K-Ras fehérje szerkezetét vizsgáljuk NMR spektroszkópiával, korábban már kidolgozott körülmények között, hogy láthassuk, okoz-e térszerkezeti változást a konjugált peptid a célfehérjén. Ezután az emlős sejtekből készített lizátum erősen összetett rendszerében vizsgáljuk meg a fehérje szerkezetét NMR segítségével, így összehasonlítási alapot kapunk sejten belüli vizsgálatokhoz. Miután bizonyítottuk a konjugált peptid képességét hozzákapcsolt fehérje emlőssejtekbe juttatására térszerkezetváltozás nélkül, nagymennyiségű izotópjelölt fehérjét juttatunk a sejtekbe, és ennek szerkezetét NMR spektroszkópiával fogjuk vizsgálni (in cell NMR).*
Hosszú távú tervünk kismolekulás kötődés vizsgálata sejten belül a K-Ras fehérje onkogén mutáns változata esetében.
* Barbieri L, Luchinat E, Banci L (2016): Characterization of proteins by in-cell NMR spectroscopy in cultured mammalian cells, Nat Protoc. 11(6), 1101-1111.
Uray Katalin, Pálfy Gyula, Vida István